Wilms 瘤基因1 低表达和过表达乳腺癌细胞模型的建立

doi:10.3877/cma. j. issn.1674-0807.2013.04.001

目的

应用RNA 干扰(RNAi)和RNA 激活(RNAa)技术,分别构建小干扰RNA(siRNA)和双链RNA(dsRNA),建立Wilms 瘤基因1(WT1)低表达和过表达的乳腺癌细胞模型。

方法

以国外学者提供的3 条序列(siRNA-516、siRNA-803、siRNA-1029)构建WT1 siRNA 干扰表达WT1,以研究已证实可上调WT1 表达的序列(dsRNA-319)构建dsRNA 过表达WT1,通过脂质体(Lipofectamine^TM 2000)分别将siRNA 和dsRNA 转入MDA-MB-321 和MCF-7 细胞。 WT1 有效siRNA 筛选实验分为6 组:WT1 siRNA-516、WT1 siRNA-803、WT1 siRNA-1029、阴性对照、脂质体组和空白细胞组;观察转染效率的时间点为转染后24、48、72 h。 WT1 dsRNA 的筛选实验分为3 组:WT1 dsRNA-319、阴性对照组和空白细胞组;观察转染效率的时间点为转染后48、72、96 h。通过实时定量PCR(qRT-PCR)和Western Blotting 筛选作用效果最明显的siRNA 和dsRNA。使用单因素方差分析进行统计学分析。

结果

成功构建WT1 siRNA-516、WT1 siRNA-803 和WT1 siRNA-1029 共3 个siRNA,并转染到MDA-MB-231 细胞中,转染效率达90%以上。上述3 个WT1 siRNA 均能够抑制WT1 mRNA 和蛋白的表达,以转染后48 h WT1 siRNA-1029的效果最为显著[WT1 siRNA-1029 组WT1 mRNA 表达水平与空白细胞组相比显著降低(0.49±0.02 比1.00±0.08,P=0.00),其蛋白表达水平也明显降低]。成功将WT1 dsRNA-319 转染到MCF-7 细胞中,转染效率达90%以上。 50 μmol/L 的WT1 dsRNA-319 转染后96 h,MCF-7 细胞的WT1 过表达最为显著[WT1 dsRNA-319 组的WT1 mRNA 表达水平与空白细胞组相比显著升高(319.06±14.84 比1.00±0.07,P=0.00),其蛋白表达水平也明显升高]。

结论

成功建立低表达WT1 的MDA-MB-231 细胞和过表达WT1 的MCF-7 细胞模型,为后续进一步研究WT1 在乳腺癌中的生物学行为奠定了基础。

关键词: Wilms 瘤基因1, RNA 干扰, RNA 激活, 乳腺肿瘤

Objective

To construct small interfering RNA (siRNA) and double strands RNA(dsRNA) by RNA interference (RNA interference, RNAi) and RNA activation (RNA activating, RNAa),and establish the low and over-expression model of Wilms’ tumor gene 1 (WT1) in breast cancer cells.

Methods

Three sequences (siRNA-516, siRNA-803 and siRNA-1029) established by foreign scholars were adopted to construct WT1 siRNA; one sequence (dsRNA-319)which demonstrated to be able to up-regulate WT1 expression was adopted to construct WT1 dsRNA. siRNA and dsRNA were transfected into MDA-MB-321 and MCF-7 cells by Lipofectamine^TM 2000,respectively. WT1 siRNA screening experiment contained six groups:WT1 siRNA-516, WT1 siRNA-803, WT1 siRNA-1029, negative control, transfection reagent and blank groups, and the points of time for observation were at 24, 48 and 72 h after transfection, respectively. WT1 dsRNA screening experiments contained three groups: WT1 dsRNA-319, negative control and blank group, and the point of time for observation was at 48, 72 and 96 h after transfection respectively. Quantitative real-time PCR(qRT-PCR)and Western Blotting were performed to select siRNA and dsRNA with obvious impacts on WT1 expression. The one-way ANOVA was used for statistical analysis.

Results

Three WT1 siRNAs (WT1 siRNA-516, WT1 siRNA-803 and WT1 siRNA-1029) were successfully constructed and transfected into MDAMB-231 cells with transfection efficiency ＞90%. WT1 siRNAs could effectively inhibit the expression of WT1 mRNA and protein, among which siRNA-1029 could inhibit the WT1 mRNA expression at 48 h after transfection most significantly (0.49±0.02 for WT1 siRNA-1029 group vs 1.00±0.08 for blank group,P=0.00;the protein expression was also decreased dramatically). WT1 dsRNA-319 could increase the expression of WT1 mRNA in MCF-7 cell with transfection efficiency ＞90%. The most significant impact was achieved in 50 μmol/L WT1 dsRNA-319 group at 96 h after transfection (319.06±14.84 for WT1 dsRNA-319 group vs 1.00±0.07 for blank group, P=0.00; the protein expression was also increased remarkably).

Conclusion

The low expression WT1 model in MDA-MB-231 cells and the over-expression WT1 model in MCF-7 cells are successfully established, which provides a basis for subsequent study on WT1 biological behaviors in breast cancer.

Key words: Wilms’ tumor gene 1, RNA interference, RNA activating, Breast neoplasms

表1 Wilms 瘤基因1(WT1) 小干扰RNA(siRNA)序列

siRNA	靶点	序列	荧光标记
WT1 siRNA-516	外显子4	5′-GACAAUUUAUACCAAAUGATT-3′	FAM
WT1 siRNA-803	外显子7	5′-GCUGUCCCACUUACAGAUGdTdT-3′	FAM
WT1 siRNA-1029	外显子10	5′-AAGCCCUUCAGCUGUCGGUdTdT-3′	FAM
WT1 siRNA-NC		5′-CGUACGCGGAAUACUUCGAdTdT-3′	FAM

表1 Wilms 瘤基因1(WT1) 小干扰RNA(siRNA)序列

siRNA	靶点	序列	荧光标记
WT1 siRNA-516	外显子4	5′-GACAAUUUAUACCAAAUGATT-3′	FAM
WT1 siRNA-803	外显子7	5′-GCUGUCCCACUUACAGAUGdTdT-3′	FAM
WT1 siRNA-1029	外显子10	5′-AAGCCCUUCAGCUGUCGGUdTdT-3′	FAM
WT1 siRNA-NC		5′-CGUACGCGGAAUACUUCGAdTdT-3′	FAM

表2 Wilms 瘤基因1(WT1) 双链RNA(dsRNA)序列

dsRNA	序列	末端标记
WT1 dsRNA-319	5′-FGACUCACUGCUUACCUGAA[dT][dT] -3′	HPLC
WT1 dsRNA-319	5′-RUUCAGGUAAGCAGUGAGUC[dT][dT] -3′	HPLC
WT1 dsRNA-NC	5′-ACUACUGAG UGACAGUAGA[dT][dT] -3′	FAM
WT1 dsRNA-NC	5′-UCUACUGUCACUCAGUAGU[dT][dT] -3′	FAM

表2 Wilms 瘤基因1(WT1) 双链RNA(dsRNA)序列

dsRNA	序列	末端标记
WT1 dsRNA-319	5′-FGACUCACUGCUUACCUGAA[dT][dT] -3′	HPLC
WT1 dsRNA-319	5′-RUUCAGGUAAGCAGUGAGUC[dT][dT] -3′	HPLC
WT1 dsRNA-NC	5′-ACUACUGAG UGACAGUAGA[dT][dT] -3′	FAM
WT1 dsRNA-NC	5′-UCUACUGUCACUCAGUAGU[dT][dT] -3′	FAM

图1 显微镜下观察不同比例的脂质体与羧基荧光素(FAM)-小干扰RNA 转染MDA-MB-231 细胞的效率(×200) a,e:0.25 μl 脂质体∶2.5 pmol siRNA; b,f:0.25 μl 脂质体∶5 pmol siRNA; c,g:0.5 μl 脂质体与∶5 pmol siRNA; d,h:1 μl 脂质体∶10 pmol siRNA (a ～d:倒置相差显微镜观察;e ～h:荧光显微镜观察)

图2 荧光显微镜观察羧基荧光素(FAM)-小干扰RNA 转染MDA-MB-231 细胞的效果(×400) a:白光图;b:荧光图;c:白光图与荧光图合成的图像

图3 Western Bloting 检测WT1 小干扰RNA 转染后24、48、72 h MDA-MB-231 细胞中WT1 蛋白的表达水平 a:转染后24 h;b:转染后48 h;c:转染后72 h 1 ～6 分别代表WT1 siRNA-516、WT1 siRNA-803、WT1 siRNA-1029、阴性对照、脂质体和空白细胞组; WT1: Wilms 瘤基因1

表3 siRNA 转染后24、48、72 h 各组MDA-MB-231细胞的WT1 mRNA 相对表达量比较

组别	实验次数	WT1 mRNA 相对表达量
组别	实验次数	24 h^a	48 h^b	72 h^b
空白细胞组	3	1.00±0.08	1.00±0.08	1.00±0.01
脂质体组	3	0.94±0.04	0.94±0.04	0.85±0.02
阴性对照组	3	1.02±0.18	0.91±0.09	0.93±0.02
WT1 siRNA-516组	3	0.75±0.05	0.49±0.03^c	0.55±0.02^c
WT1 siRNA-803组	3	0.66±0.05	0.45±0.04^c	0.58±0.01^c
WT1 siRNA-1029组	3	0.71±0.06	0.49±0.02^c	0.70±0.01^c
F值		9.60	63.35	345.71
P值		0.00	0.00	0.00

表3 siRNA 转染后24、48、72 h 各组MDA-MB-231细胞的WT1 mRNA 相对表达量比较

组别	实验次数	WT1 mRNA 相对表达量
组别	实验次数	24 h^a	48 h^b	72 h^b
空白细胞组	3	1.00±0.08	1.00±0.08	1.00±0.01
脂质体组	3	0.94±0.04	0.94±0.04	0.85±0.02
阴性对照组	3	1.02±0.18	0.91±0.09	0.93±0.02
WT1 siRNA-516组	3	0.75±0.05	0.49±0.03^c	0.55±0.02^c
WT1 siRNA-803组	3	0.66±0.05	0.45±0.04^c	0.58±0.01^c
WT1 siRNA-1029组	3	0.71±0.06	0.49±0.02^c	0.70±0.01^c
F值		9.60	63.35	345.71
P值		0.00	0.00	0.00

图4 荧光显微镜观察羧基荧光素(FAM)- Wilms 瘤基因1(WT1)双链RNA-319 转染MCF-7 细胞的效果(×400) a:白光图;b:荧光图;c:白光图与荧光图合成的图像

图5 Western Bloting 检测WT1 dsRNA 转染后96 h MCF-7细胞的WT1 蛋白表达水平 Blank:空白细胞组;WT1:Wilms 瘤基因1;dsRNA:双链RNA

表4 dsRNA 转染48、72、96 h 后各组MCF-7 细胞的WT1 mRNA 相对表达量比较

组别	实验次数	mRNA 相对表达量
组别	实验次数	48 h^a	72 h^b	96 h^b
空白细胞组	3	1.00±0.07	1.00±0.08	1.00±0.07
阴性对照组	3	0.94±0.02	0.92±0.05	0.94±0.03
WT1 dsRNA-319	3	0.69±0.07^c	1.53±0.01^c	319.06±14.84^c
F值		22.28	117.58	1378.27
P值		0.00	0.00	0.00

表4 dsRNA 转染48、72、96 h 后各组MCF-7 细胞的WT1 mRNA 相对表达量比较

组别	实验次数	mRNA 相对表达量
组别	实验次数	48 h^a	72 h^b	96 h^b
空白细胞组	3	1.00±0.07	1.00±0.08	1.00±0.07
阴性对照组	3	0.94±0.02	0.92±0.05	0.94±0.03
WT1 dsRNA-319	3	0.69±0.07^c	1.53±0.01^c	319.06±14.84^c
F值		22.28	117.58	1378.27
P值		0.00	0.00	0.00

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Establishment of the Wilms’ tumor gene 1 low and over-expression models in breast cancer cells

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