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中华乳腺病杂志(电子版)

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2013 , Vol. 07 >Issue 04: 238 - 244

DOI: https://doi.org/10.3877/cma. j. issn.1674-0807.2013.04.001

论著

Wilms 瘤基因1 低表达和过表达乳腺癌细胞模型的建立

  • 齐晓伟 1 ,
  • 杨新华 1 ,
  • 张毅 1 ,
  • 范林军 1 ,
  • 张帆 1 ,
  • 陈莉 1 ,
  • 唐振宁 1 ,
  • 张彦 1 ,
  • 杨晓宁 1 ,
  • 宗贝歌 1 ,
  • 胡保全 1 ,
  • 王明浩 1 ,
  • 姜军 , 1, †
展开
  • 1.400038 重庆,第三军医大学西南医院乳腺外科
姜军,Email:
<i> JIANG Jun, Email: </i>

Copy editor: 罗承丽

收稿日期: 2013-07-10

  网络出版日期: 2024-12-05

基金资助

国家自然科学基金资助项目(81102030)

版权

版权归中华医学会所有。 未经授权，不得转载、摘编本刊文章，不得使用本刊的版式设计。 除非特别声明，本刊刊出的所有文章不代表中华医学会和本刊编委会的观点。
收起

Establishment of the Wilms’ tumor gene 1 low and over-expression models in breast cancer cells

  • Xiao-wei QI 1 ,
  • Xin-hua YANG 1 ,
  • Yi ZHANG 1 ,
  • Lin-jun FAN 1 ,
  • Fan ZHANG 1 ,
  • Li CHEN 1 ,
  • Zhen-ning TANG 1 ,
  • Yan ZHANG 1 ,
  • Xiao-ning YANG 1 ,
  • Bei-ge ZONG 1 ,
  • Bao-quan HU 1 ,
  • Ming-hao WANG 1 ,
  • Jun JIANG , 1, †
Expand
  • 1.Department of Breast Surgery,Southwest Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400038, China

Received date: 2013-07-10

  Online published: 2024-12-05

Copyright

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Fold

摘要

目的

应用RNA 干扰(RNAi)和RNA 激活(RNAa)技术,分别构建小干扰RNA(siRNA)和双链RNA(dsRNA),建立Wilms 瘤基因1(WT1)低表达和过表达的乳腺癌细胞模型。

方法

以国外学者提供的3 条序列(siRNA-516、siRNA-803、siRNA-1029)构建WT1 siRNA 干扰表达WT1,以研究已证实可上调WT1 表达的序列(dsRNA-319)构建dsRNA 过表达WT1,通过脂质体(LipofectamineTM 2000)分别将siRNA 和dsRNA 转入MDA-MB-321 和MCF-7 细胞。 WT1 有效siRNA 筛选实验分为6 组:WT1 siRNA-516、WT1 siRNA-803、WT1 siRNA-1029、阴性对照、脂质体组和空白细胞组;观察转染效率的时间点为转染后24、48、72 h。 WT1 dsRNA 的筛选实验分为3 组:WT1 dsRNA-319、阴性对照组和空白细胞组;观察转染效率的时间点为转染后48、72、96 h。 通过实时定量PCR(qRT-PCR)和Western Blotting 筛选作用效果最明显的siRNA 和dsRNA。 使用单因素方差分析进行统计学分析。

结果

成功构建WT1 siRNA-516、WT1 siRNA-803 和WT1 siRNA-1029 共3 个siRNA,并转染到MDA-MB-231 细胞中,转染效率达90%以上。 上述3 个WT1 siRNA 均能够抑制WT1 mRNA 和蛋白的表达,以转染后48 h WT1 siRNA-1029的效果最为显著[WT1 siRNA-1029 组WT1 mRNA 表达水平与空白细胞组相比显著降低(0.49±0.02 比1.00±0.08,P=0.00),其蛋白表达水平也明显降低]。 成功将WT1 dsRNA-319 转染到MCF-7 细胞中,转染效率达90%以上。 50 μmol/L 的WT1 dsRNA-319 转染后96 h,MCF-7 细胞的WT1 过表达最为显著[WT1 dsRNA-319 组的WT1 mRNA 表达水平与空白细胞组相比显著升高(319.06±14.84 比1.00±0.07,P=0.00),其蛋白表达水平也明显升高]。

结论

成功建立低表达WT1 的MDA-MB-231 细胞和过表达WT1 的MCF-7 细胞模型,为后续进一步研究WT1 在乳腺癌中的生物学行为奠定了基础。

关键词： Wilms 瘤基因1; RNA 干扰; RNA 激活; 乳腺肿瘤

本文引用格式

齐晓伟 , 杨新华 , 张毅 , 范林军 , 张帆 , 陈莉 , 唐振宁 , 张彦 , 杨晓宁 , 宗贝歌 , 胡保全 , 王明浩 , 姜军 . Wilms 瘤基因1 低表达和过表达乳腺癌细胞模型的建立[J]. 中华乳腺病杂志(电子版), 2013 , 07(04) : 238 -244 . DOI: 10.3877/cma. j. issn.1674-0807.2013.04.001

Abstract

Objective

To construct small interfering RNA (siRNA) and double strands RNA(dsRNA) by RNA interference (RNA interference, RNAi) and RNA activation (RNA activating, RNAa),and establish the low and over-expression model of Wilms’ tumor gene 1 (WT1) in breast cancer cells.

Methods

Three sequences (siRNA-516, siRNA-803 and siRNA-1029) established by foreign scholars were adopted to construct WT1 siRNA; one sequence (dsRNA-319)which demonstrated to be able to up-regulate WT1 expression was adopted to construct WT1 dsRNA. siRNA and dsRNA were transfected into MDA-MB-321 and MCF-7 cells by LipofectamineTM 2000,respectively. WT1 siRNA screening experiment contained six groups:WT1 siRNA-516, WT1 siRNA-803, WT1 siRNA-1029, negative control, transfection reagent and blank groups, and the points of time for observation were at 24, 48 and 72 h after transfection, respectively. WT1 dsRNA screening experiments contained three groups: WT1 dsRNA-319, negative control and blank group, and the point of time for observation was at 48, 72 and 96 h after transfection respectively. Quantitative real-time PCR(qRT-PCR)and Western Blotting were performed to select siRNA and dsRNA with obvious impacts on WT1 expression. The one-way ANOVA was used for statistical analysis.

Results

Three WT1 siRNAs (WT1 siRNA-516, WT1 siRNA-803 and WT1 siRNA-1029) were successfully constructed and transfected into MDAMB-231 cells with transfection efficiency ＞90%. WT1 siRNAs could effectively inhibit the expression of WT1 mRNA and protein, among which siRNA-1029 could inhibit the WT1 mRNA expression at 48 h after transfection most significantly (0.49±0.02 for WT1 siRNA-1029 group vs 1.00±0.08 for blank group,P=0.00;the protein expression was also decreased dramatically). WT1 dsRNA-319 could increase the expression of WT1 mRNA in MCF-7 cell with transfection efficiency ＞90%. The most significant impact was achieved in 50 μmol/L WT1 dsRNA-319 group at 96 h after transfection (319.06±14.84 for WT1 dsRNA-319 group vs 1.00±0.07 for blank group, P=0.00; the protein expression was also increased remarkably).

Conclusion

The low expression WT1 model in MDA-MB-231 cells and the over-expression WT1 model in MCF-7 cells are successfully established, which provides a basis for subsequent study on WT1 biological behaviors in breast cancer.

Key words： Wilms’ tumor gene 1; RNA interference; RNA activating; Breast neoplasms

乳腺癌是女性最常见和病死率最高的恶性肿瘤[1],但具体发病和进展过程及机制至今尚不明确。 因此,进一步揭示已知癌基因或抑癌基因的功能,对阐明恶性肿瘤发生和演进机制具有重要意义[2]。 Wilms 瘤基因1(Wilms’ tumor gene 1,WT1)首先在肾母细胞瘤(又称Wilms 瘤)中作为抑癌基因被克隆鉴定,定位于11p13[3]。 WT1 在成人组织中的异常表达与多种恶性肿瘤的发生密切相关,但根据细胞特征不同,其可发挥癌基因或抑癌基因作用[4]。 笔者前期的研究结果[5]以及其他学者的研究[6]均提示WT1 在乳腺癌的发生过程中起癌基因作用,但WT1 是否参与乳腺癌的侵袭转移过程、具体作用及分子机制如何,至今尚不清楚。 为进一步探讨上述问题,本研究拟应用RNA 干扰(RNA interference, RNAi)和RNA 激活(RNA activating, RNAa)方法,利用小干扰RNA(small interfering RNA, siRNA) 和双链 RNA(double strands RNA, dsRNA)分别建立WT1 低表达和高表达的乳腺癌细胞模型,以期为后续进一步研究WT1 在乳腺癌中的生物学功能提供实验基础。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

乳腺癌MDA-MB-231 和MCF-7 细胞购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库/中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心;DMEM(Dulbecco’s modified eagle medium)高糖养基购自美国Hyclone 公司;FBS 购自美国Gibco 公司;WT1 兔单克隆抗体及羊抗兔二抗抗体均购于美国Santa 公司;GAPDH 兔单克隆抗体购自美国Epitomics 公司;脂质体(LipofectamineTM 2000)购于美国Introgen 公司;RNA 裂解液、实时定量PCR(quantitative real-time-PCR,qRT-PCR)试剂盒均购于中国TaKaRa 公司;WT1 及GAPDH 引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成;倒置荧光显微镜为德国Olympus 公司产品。

1.2 细胞培养及传代

将MDA-MB-231 及MCF-7 细胞培养于含10% FBS 的DMEM 培养基,在37 ℃、5%CO2 的孵育箱中培养,常规用0.25%胰酶消化传代。 实验所用细胞均处于对数生长期。

1.3 研究设计

将不同比例的脂质体与siRNA(a:0.25 μl 脂质体∶2.5 pmol siRNA; b: 0.25 μl 脂质体∶5 pmol siRNA; c:0.5 μl 脂质体∶5 pmol siRNA;d:1 μl 脂质体∶10 pmol siRNA)混合后,分别转染MDA-MB-231 细胞,从中筛选出最佳比例的脂质体和siRNA,之后通过qRT-PCR 以及Western Blotting 筛选有效的siRNA 序列和转染时间点。
按照文献[7]推荐的浓度(50 μmol/L),在MCF-7 细胞中转染dsRNA,之后通过qRT-PCR 筛选有效时间点,并用Western Blotting 在蛋白水平进一步评估qRT-PCR 筛选出的时间点的有效性。

1.4 实验分组及转染观察时间点

MDA-MB-231 细胞WT1 有效siRNA 筛选的实验分为6 组,即WT1 siRNA-516 转染组、WT1 siRNA-803 转染组、WT1 siRNA-1029 转染组、阴性对照组(negative control, NC:WT1 siRNA 携带无关序列)、脂质体组和空白细胞组。 观察转染效率的时间点为转染后24、48、72 h。
MCF-7 细胞WT1 dsRNA 的筛选实验分3 组,即WT1 dsRNA-319 转染组、阴性对照组和空白细胞组。 根据文献[7-8],选取50 μmol/L 为dsRNA的转染浓度。 观察转染效率的时间点为转染后48、72、96 h。

1.5 WT1 siRNA 的合成

WT1 siRNA 序列由西班牙纳瓦拉大学(University of Navarra)的Carmen Berasain 教授友情提供[9]。分别针对WT1 基因外显子4、7 和10 设计的WT1 siRNA-516、WT1 siRNA-803 和WT1 siRNA-1029序列,以及siRNA-NC 序列均由上海吉玛制药有限公司提供(所有序列见表1)。 羧基荧光素(carboxyfluorescein, FAM) 标记的WT1 siRNA-516、WT1 siRNA-803、WT1 siRNA-1029 及WT1 siRNA-NC 均由上海吉玛制药有限公司合成,并通过测序等质检过程。
表1 Wilms 瘤基因1(WT1) 小干扰RNA(siRNA)序列
siRNA 靶点 序列 荧光标记
WT1 siRNA-516 外显子4 5′-GACAAUUUAUACCAAAUGATT-3′ FAM
WT1 siRNA-803 外显子7 5′-GCUGUCCCACUUACAGAUGdTdT-3′ FAM
WT1 siRNA-1029 外显子10 5′-AAGCCCUUCAGCUGUCGGUdTdT-3′ FAM
WT1 siRNA-NC 5′-CGUACGCGGAAUACUUCGAdTdT-3′ FAM

1.6 WT1 dsRNA 的合成

WT1 dsRNA 序列(WT1 dsRNA-319 和WT1 dsRNA-NC,序列见表2)由美国加利福尼亚大学(University of California)的Li Cheng-long 教授设计[7]。 高效液相色谱法(high performance liquid chromatography, HPLC)纯化的WT1 dsRNA-319和荧光标记的WT1 dsRNA-NC 均由上海吉玛制药有限公司合成,并通过测序等质检过程。
表2 Wilms 瘤基因1(WT1) 双链RNA(dsRNA)序列
dsRNA 序列 末端标记
WT1 dsRNA-319 5′-FGACUCACUGCUUACCUGAA[dT][dT] -3′ HPLC
5′-RUUCAGGUAAGCAGUGAGUC[dT][dT] -3′
WT1 dsRNA-NC 5′-ACUACUGAG UGACAGUAGA[dT][dT] -3′ FAM
5′-UCUACUGUCACUCAGUAGU[dT][dT] -3′

1.7 WT1 siRNA 和WT1 dsRNA 的转染

siRNA 以及dsRNA 的转染均严格按照脂质体操作说明书进行操作。
siRNA 转染:转染前1 d,将(3 ～5)×105 个MDA-MB-231 细胞接种于6 孔板中,使转染时细胞融合度能够达到30% ～50%。 转染时,首先取5 μl 脂质体(使用前轻轻摇匀),用250 μl Opti-MEM 减血清培养基稀释,轻轻混和后在室温孵育5 min;之后,取5 μl FAM-siRNA,用250 μl Opti-MEM 减血清培养基稀释,轻轻混和均匀;随后,将稀释的脂质体与稀释FAM-siRNA 轻轻混和,室温静置20 min,以形成FAM-siRNA-转染试剂混和液;最后,将FAM-siRNA-转染试剂混和液加入含有细胞及培养液(约含1.5 ml)的孔中,轻轻摇晃孔板,使之混和,并置于37 ℃的CO2 培养箱中培养。 4 ～6 h 后,将培养基换为含血清的完全培养基,同时利用荧光显微镜观察荧光标记细胞与总细胞的比例,评估转染效率[10]。
dsRNA 转染MCF-7 细胞的方法和转染效率评价同上。

1.8 qRT-PCR 检测各组WT1 mRNA 的表达情况

按上述实验分组和转染观察时间点,提取细胞总RNA,按TaKaRa 试剂盒说明书进行反转录和PCR 反应。 引物序列:WT1 上游引物5′-ccacac caggactcatacagg-3′,下游引物5′-atgttgtgatggcggactaat-3′;GAPDH 上游引物5′-ctttggtatcgtggaaggactc-3′,下游引物5′-gtagaggcagggatgatgttct-3′。 反转录条件:42 ℃15 min,85 ℃5 s,4 ℃5 min。 qRT-PCR 反应条件:95 ℃预变性90 s,95 ℃5 s、62.5 ℃30 s共40 个循环进行扩增,65 ℃1 s 进行融解曲线分析。 实验重复3 次,根据2-△△Ct 法[10-11]计算WT1 mRNA 相对表达量(即目的基因的Ct 值与GAPDH Ct 值的比值)并进行统计。

1.9 Western Blotting 检测WT1 蛋白的表达情况

按上述实验分组和转染观察时间点,用细胞裂解液提取各组细胞上清液中的总蛋白,用Bradford法检测其浓度。 取50 μg WT1 蛋白行12% 的SDS-PAGE 并转聚偏二氟乙烯膜,用含5%脱脂奶粉的封闭液室温封闭4 h,加1 ∶1000 稀释的一抗37 ℃孵育4 h,用洗涤缓冲液漂洗后加1 ∶2500稀释的辣根过氧化物酶标记的二抗,于37 ℃孵育2 h 后,加电化学发光显色试剂在暗室中进行曝光和显影。 通过对胶片进行扫描,比较各组灰度值的变化。

1.10 统计学分析

采用SPSS 17.0 统计软件进行分析,计量资料以±s 表示,多组数据比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用LSD(方差整齐) 或者Tamhane’s T2(M)(方差不整齐)检验,以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 在MDA-MB-231 细胞中确定最佳的脂质体与siRNA 的比例

显微镜下观察,不同比例的脂质体∶siRNA组均能达到90%左右转染效率(图1)。 综合考虑不同比例组的转染效率及细胞状态,后续实验以0.25 μl 脂质体∶2.5 pmol siRNA 的比例转染MDAMB-231 细胞。 按此比例(脂质体/siRNA)扩大培养体积在六孔板中进行细胞转染,荧光显微镜下观察到转染效率达90%以上(图2)。
图1 显微镜下观察不同比例的脂质体与羧基荧光素(FAM)-小干扰RNA 转染MDA-MB-231 细胞的效率(×200)

a,e:0.25 μl 脂质体∶2.5 pmol siRNA; b,f:0.25 μl 脂质体∶5 pmol siRNA; c,g:0.5 μl 脂质体与∶5 pmol siRNA; d,h:1 μl 脂质体∶10 pmol siRNA (a ～d:倒置相差显微镜观察;e ～h:荧光显微镜观察)

图2 荧光显微镜观察羧基荧光素(FAM)-小干扰RNA 转染MDA-MB-231 细胞的效果(×400)

a:白光图;b:荧光图;c:白光图与荧光图合成的图像

2.2 WT1 siRNA 有效序列的筛选

与空白细胞组相比,WT1 siRNA-516、WT1 siRNA-803 和WT1 siRNA-1029 在转染后24、48、72 h 均能显著降低MDA-MB-231 细胞的WT1 mRNA 表达水平(统计结果详见表3)。 WT1-siRNA-1029 在转染后48 h 时可显著降低MDAMB-231 细胞中WT1 蛋白的表达水平(图3)。 结合qRT-PCR 与Western Blotting 结果,确定WT1 siRNA-1029 在转染后48 h 对MDA-MB-231 细胞的干扰效率最佳,可以此作为后续功能实验的转染对象和条件。
图3 Western Bloting 检测WT1 小干扰RNA 转染后24、48、72 h MDA-MB-231 细胞中WT1 蛋白的表达水平

a:转染后24 h;b:转染后48 h;c:转染后72 h 1 ～6 分别代表WT1 siRNA-516、WT1 siRNA-803、WT1 siRNA-1029、阴性对照、脂质体和空白细胞组; WT1: Wilms 瘤基因1

表3 siRNA 转染后24、48、72 h 各组MDA-MB-231细胞的WT1 mRNA 相对表达量比较
组别 实验次数 WT1 mRNA 相对表达量
24 ha 48 hb 72 hb
空白细胞组 3 1.00±0.08 1.00±0.08 1.00±0.01
脂质体组 3 0.94±0.04 0.94±0.04 0.85±0.02
阴性对照组 3 1.02±0.18 0.91±0.09 0.93±0.02
WT1 siRNA-516组 3 0.75±0.05 0.49±0.03c 0.55±0.02c
WT1 siRNA-803组 3 0.66±0.05 0.45±0.04c 0.58±0.01c
WT1 siRNA-1029组 3 0.71±0.06 0.49±0.02c 0.70±0.01c
F值 9.60 63.35 345.71
P值 0.00 0.00 0.00

2.3 WT1 dsRNA 转染效率的评价

用50 μmol/L WT1 dsRNA-319 转染MCF-7细胞4 ～6 h 后,在荧光显微镜下观察转染效率均能达到90%左右(图4)。
图4 荧光显微镜观察羧基荧光素(FAM)- Wilms 瘤基因1(WT1)双链RNA-319 转染MCF-7 细胞的效果(×400)

a:白光图;b:荧光图;c:白光图与荧光图合成的图像

2.4 WT1 dsRNA 有效作用时间的筛选

与空白细胞组相比,WT1 dsRNA-319 在转染MCF-7 细胞后72、96 h 均可显著提高WT1 mRNA表达水平,并且96 h 时最为显著(统计结果详见表4)。 同时,在96 h 时检测WT1 dsRNA-319 和空白细胞组的WT1 蛋白表达情况,同样发现WT1 dsRNA-319 可以增强WT1 蛋白的表达(图5),进一步证实了96 h 为最佳转染时间点。
图5 Western Bloting 检测WT1 dsRNA 转染后96 h MCF-7细胞的WT1 蛋白表达水平

Blank:空白细胞组;WT1:Wilms 瘤基因1;dsRNA:双链RNA

表4 dsRNA 转染48、72、96 h 后各组MCF-7 细胞的WT1 mRNA 相对表达量比较
组别 实验次数 mRNA 相对表达量
48 ha 72 hb 96 hb
空白细胞组 3 1.00±0.07 1.00±0.08 1.00±0.07
阴性对照组 3 0.94±0.02 0.92±0.05 0.94±0.03
WT1 dsRNA-319 3 0.69±0.07c 1.53±0.01c 319.06±14.84c
F值 22.28 117.58 1378.27
P值 0.00 0.00 0.00

3 讨论

WT1 编码产物是一种具有转录激活和抑制双重功能的锌指转录因子。 在发育过程中,WT1通过调控多种靶基因和信号通路参与心脏、肾脏和脾脏等器官的形成。 在成人组织中,WT1 对靶基因的转录起激活还是抑制作用具有高度的细胞和组织特异性[12]。 一方面,在Wilms 瘤中WT1通过干扰细胞增殖信号等途径抑制细胞生长,发挥抑癌基因作用[3];另一方面,WT1 可增强肿瘤细胞的抗凋亡能力[13],并通过调控原癌基因K-ras促进细胞增殖[14],提示WT1 也能发挥癌基因作用。 乳腺癌是一种具有多种组织学和病理学特征的恶性肿瘤[15],目前关于WT1 在乳腺癌进展中的具体作用和机制至今尚不清楚,其促进还是抑制细胞增殖尚存争议,而其是否参与乳腺癌的侵袭转移过程、具体作用及分子机制如何,鲜见文献报道。 因此,有必要开展进一步的临床和基础研究对上述问题进行深入探讨,而在乳腺癌细胞中建立WT1 干预表达的细胞模型是开展相关工作的基础。
RNA 干扰是通过dsRNA 特异性阻断靶基因,导致其mRNA 降解,诱使目的基因表达或功能丧失或表现出特定基因缺乏的表型,从而达到转录后水平的基因沉默的过程,目前已广泛用于基因功能及基因治疗的研究[16]。 RNA 激活是一种由多种小分子RNA 介导的基因激活机制,这些小分子RNA 被称为小激活RNA(small activating RNA,saRNA),saRNA 包括dsRNA、微小RNA(microRNA,miRNA)和piwi 相关作用RNA (piwi-interacting RNA,piRNA)等。 saRNA 可与特定基因启动子区域和基因反义转录物靶向结合,通过表观遗传学机制调控靶基因的转录,也可直接促进靶mRNA的翻译或拮抗miRNA 与靶mRNA 3′UTR 区(3′untranslated region,3′UTR)的结合,从而增强基因的转录后表达。 saRNA 具有独特的基因表达调控方式和特点,其干预基因表达具有较好的靶向特异性、靶基因及靶位点选择的灵活性和作用的持久性和强效性[17-20]。 RNAi 和RNAa 技术在恶性肿瘤发病机制研究和肿瘤治疗方面具有广阔的应用前景。 乳腺癌的发生是多个基因改变的结果,是上述技术应用的最佳的肿瘤模型之一。
本研究在前期发现MDA-MB-231 细胞高表达WT1、MCF-7 细胞低表达WT1 的基础上[21],成功构建WT1 siRNA-516、WT1 siRNA-803 和WT1 siRNA-1029 并转染到MDA-MB-231 细胞中,且确定最佳转染比例为0.25 μl 脂质体∶2.5 pmol siRNA,同时发现上述3 个siRNA 均能够有效抑制WT1 mRNA 和蛋白的表达,并且在转染后48 h时,3 个siRNA 均能有效抑制WT1 mRNA 水平,以WT1 siRNA-803 最为明显,WT1 siRNA-1029 和WT1 siRNA-506 次之,但WT1 siRNA-1029 对WT1蛋白表达水平抑制效果最为明显,远高于其他2 个siRNA,综合考虑确定WT1 siRNA-1029 在转染后48 h 时对MDA-MB-231 细胞的WT1 表达水平抑制最为明显。 此外,本研究还成功将WT1 dsRNA-319 转染到MCF-7 细胞中,转染效率达90%以上。 并且,50 μmol/L WT1 dsRNA-319 转染MCF-7 细胞后96 h 时WT1 mRNA 过表达水平最为显著,进一步通过Western Blotting 检测证实,WT1 dsRNA-319 转染MCF-7 细胞后96 h 时WT1蛋白的表达水平升高最为明显。 但由于实验设计及具体操作等问题,未能在各个时间点均对MCF-7细胞进行WT1 蛋白表达的检测,需要在后续的实验中补充完善。
综上所述,本研究成功应用RNAi 和RNAa 方法分别建立了WT1 低表达和高表达的乳腺癌细胞模型,为后续开展WT1 的功能学实验奠定了基础。

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